4. 在新界面的右侧选择「NCBI Reference Sequences（RefSeq）」后，界面跳转到「mRNA and Protein(s)」中找到「NM_000546.6」，然后选择基因的「CDS」 区，点击「FASTA」。

5. 在 Primer Premier 5 中粘贴 CDS 序列，选择「As is」，点击「Ok」。

6. 点击左上角的「Primer」，在弹出的新界面中选择「Search」。

7. 在「Search for」中如设计 PCR 的引物就选择「PCR Primers」，设计测序引物就选择「Sequencing primers」，在「Search Type」中选择「Pairs」。然后根据需要调整具体参数（如 PCR 产物长度一般为 100-300，引物长度一般为 20 左右），最后点击「OK」。

8. 在新界面点击「OK」，发现一共设计出 100 对引物。

9. 在结果中（右侧区域）引物是按照评分由高到低排序的，先选择第一对引物，引物具体信息会展示出来。左上角的 S/A 可以切换上下游引物， 尽可能符合以下要求来选择合适的引物序列：

sense，anti-sense 最好都是 None；

ΔG 绝对值小于 10；

Tm 在 58 左右，上下游数值相差不超过 5；

GC% 在 40%-60%，上下游数值相差不超过 5；

末端不能是 A，不能有连续 3 个相同的碱基；

3' 端一定不能有错配；

sense，anti-sense 最好都是 None；

ΔG 绝对值小于 10；

Tm 在 58 左右，上下游数值相差不超过 5；

GC% 在 40%-60%，上下游数值相差不超过 5；

末端不能是 A，不能有连续 3 个相同的碱基；

3' 端一定不能有错配；

10. 可以根据引物筛选原则进行引物编辑，如选择「Edit Primers」删除多余碱基，然后点击「Analyze」，最后点击「OK」。

11. 导出结果：点击 Edit-copy-sense primer/Anti sense primer，然后粘贴到 Excel 中。

常见问题解答 (FAQ)

Q1: 设计出的引物，评分 99 分和 95 分有多大区别？

A: 通常差别不大。评分 99 分的引物可能在某些次要参数上略优于 95 分的。应该同时查看它们的二级结构和「False Priming」情况，并且根据引物筛选原则进行判断，如果 95 分的在这些方面表现更好，完全可以选 95 分的。

Q2: 「False Priming」结果怎么看？

A: 结果会显示引物在模板上所有可能的结合位点，并给出一个评分。评分越高，表示错配引发的可能性越大。应该选择那些在非目标位点评分很低或没有结合位点的引物。

Q3: 如果想在引物 5' 端加一个酶切位点，该怎么办？

A: 使用手动编辑功能。先通过自动搜索找到一个核心结合区域好的引物，然后在其 5' 端直接添加上酶切位点序列。由于 5' 端不参与模板的特异性结合，所以这样操作是可行的。添加后，软件会重新计算该引物的 Tm 值等参数。

Q4: 为什么我的模板序列无法搜索到引物？

A: 请检查：序列是否是纯 DNA 序列，没有非法字符；序列方向是否正确；搜索参数（特别是产物长度和 Tm 值）是否设置合理。可以尝试放宽搜索条件（如扩大产物长度范围、Tm 值范围）。

Q5: 如果想在质粒序列上设计引物，需要先将其线性化吗？

A: 不需要。Primer Premier 5 会将环状质粒序列视为环状来处理。当你设计引物时，软件会自动考虑环状序列的特性。当然，你也可以在序列编辑窗口中手动将其处理为线性序列。

Q6: 如何设计用于「克隆」 或 「定点突变」的引物？

A: 需要在引物的 5' 端 添加额外的序列。

Q7: 二级结构分析中的「ΔG」值代表什么？多少算可以接受？

A: ΔG（吉布斯自由能）代表结构形成的稳定性。核心原则： ΔG 的绝对值越小（越接近零或为正值），引物质量越好。ΔG 为负值： 表示该结构可以自发形成。绝对值越大（负得越多）： 表示结构越稳定，对 PCR 的负面影响越大。

通用接受标准：

发夹结构 (Hairpin): ΔG > -3.0 kcal/mol 通常可以接受。

二聚体 (Dimer): ΔG > -5.0 kcal/mol 通常可以接受。尤其要确保 3' 端没有稳定的二聚体形成。

发夹结构 (Hairpin): ΔG > -3.0 kcal/mol 通常可以接受。

二聚体 (Dimer): ΔG > -5.0 kcal/mol 通常可以接受。尤其要确保 3' 端没有稳定的二聚体形成。

题图来源：自制

编辑：冷漠小 z返回搜狐，查看更多